本方法適用于配合飼料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混料飼料、維生素預(yù)混合飼料維生素A及維生素D、維生素E的測定。參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T17817-2010《飼料中維生素A的測定高效液相色譜法》、 GB/T 17818-2010 《飼料中維生素D3的測定高效液相色譜法》、GB/T 17812-2008 《飼料中維生素E的測定高效液相色譜法》。
1、方法原理
維生素預(yù)混料中的維生素A乙酸酯、維生素D3、維生素E（dl-α-生育酚乙酸酯）用甲醇溶液提取，試液注入高效液相色譜柱，用紫外檢測器在275 nm處測定，外標(biāo)法計(jì)算維生素A、維生素D3、維生素E（dl-α-生育酚乙酸酯）含量。
2、主要儀器設(shè)備
1)高效液相色譜儀L210，帶紫外檢測器（上海儀電分析儀器有限公司）；
2)超聲波水??；
3)電子天平；
4)真空抽濾裝置。
3、實(shí)驗(yàn)方法
1、混合標(biāo)樣配置
維生素A乙酸酯、維生素D3、維生素E（dl-α-生育酚乙酸酯）標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取維生素A乙酸酯、維生素D3、維生素E (dl-α-生育酚乙酸酯)各10.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度，混勻，4℃下保存。該貯備液濃度為0.1 mg/mL。
維生素A乙酸酯、維生素D3、維生素E（dl-α-生育酚乙酸酯）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)貯備液若干毫升于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻。
2、試樣溶液的制備
稱取試樣1.00 g置于100 mL棕色容量瓶中，加入約80 mL甲醇，于 65 ℃超聲波水浴中超聲提取30 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，充分搖勻后過0.45 μm濾膜過濾。將試樣溶液進(jìn)一步稀釋至合適濃度，用于實(shí)驗(yàn)分析。
3、高效液相色譜儀參考條件
色譜柱：C18 4.6 mm(i.d)×150mm；
流動相：95%甲醇
流速：1 mL/min；
柱溫：室溫
波長：275 nm；
測定：取相同體積試樣制備液和標(biāo)準(zhǔn)使用液分別注入高效液相色譜儀，根據(jù)保留時間按定性，外標(biāo)峰面積法定量。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖
1.維生素A乙酸酯 2.維生素D3 3.維生素E
4.2工作曲線的繪制
維生素A乙酸酯工作曲線見下圖，線性相關(guān)系數(shù)：0.9998
維生素D3工作曲線見下圖，線性相關(guān)系數(shù)：0.9998
維生素E工作曲線見下圖，線性相關(guān)系數(shù)：0.9992
4.3預(yù)混料實(shí)際樣品色譜圖
