脈沖場(chǎng)凝膠電泳

 

當(dāng)雙鏈DNA分子超過一定的大小以后，DNA雙螺旋的半徑超過了凝膠的孔徑，在瓊脂糖中的電泳速度會(huì)達(dá)到極限，此時(shí)凝膠不能按照分子大小來篩分DNA,脈沖場(chǎng)電泳就解決了這一難題

脈沖電泳是在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)，周期性交替進(jìn)行的，DNA分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應(yīng)所需的時(shí)間顯著地依賴于分子大小，DNA 越大，這種構(gòu)象改變需要的時(shí)間越長(zhǎng)，重新定向的時(shí)間也越長(zhǎng)，于是在每個(gè)脈沖時(shí)間內(nèi)可用于新方向泳動(dòng)的時(shí)間越少，因而在凝膠中移動(dòng)越慢。脈沖場(chǎng)凝膠電泳可以用來分離大小從10kb到10Mb的DNA分子

脈沖場(chǎng)凝膠電泳

1 儀器： WD-2101A脈沖電泳系統(tǒng)

2 配套試劑：脈沖電泳專用瓊脂糖(SeaKem Gold Agarose)、TBE

3 染料：GelRed等

在凝膠電泳中，溫度越高，DNA移動(dòng)的速度越快，但是條帶的清晰度和分辨率會(huì)明顯下降。溫度過高會(huì)導(dǎo)致DNA帶變形或解鏈，一般設(shè)置電泳溫度為14℃

常用緩沖液是0.5×TBE

H9812，2.2s-63.8s，19h

脈沖場(chǎng)電泳常見問題及解決辦法

1）凝膠在緩沖液中漂浮–蠕動(dòng)泵的速度太快或太慢， 調(diào)到合適的速度

2）緩沖液不流動(dòng)或流速慢–檢查冷卻泵：當(dāng)冷卻泵制 冷時(shí)，如果蠕動(dòng)泵沒有開，會(huì)造成管道內(nèi)結(jié)冰，導(dǎo) 致管道堵塞

3）電泳條帶扭曲–流速太低，導(dǎo)致制冷不充分，或不 均一、緩沖液的體積不能太小

4）條帶變粗–減少上樣量

5）條帶拖尾或模糊–電場(chǎng)轉(zhuǎn)換時(shí)間不合適，優(yōu)化轉(zhuǎn)換 電場(chǎng)轉(zhuǎn)換時(shí)間、上樣量太高，調(diào)整樣品濃度

6）大片段DNA不能有效分離–將低電壓、延長(zhǎng)電場(chǎng)轉(zhuǎn)換 時(shí)間

7）條帶彎曲–緩沖液緩沖能力下降，更換緩沖液、上 樣時(shí)樣品塊被擠碎、泵速度太慢

聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Bis）在引發(fā)劑（eg.APS）和加速劑（eg.TEMED）的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡(jiǎn)稱PAGE）。
 
聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點(diǎn)：

1 在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好。

2 化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

3 對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定。

4 幾乎無電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣 品分離重復(fù)性好。

5 樣品不易擴(kuò)散，且用量少。

6 凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。

7 分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和 電荷效應(yīng)為一體，因而較醋酸 纖維薄膜電泳、瓊脂糖電 泳等有更高的分辨率。

聚丙烯酰胺凝膠聚合

聚合原理

1.聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下合成的。 催化系統(tǒng)常用有兩種： 過硫酸氨—TEMED化學(xué)催化聚合系統(tǒng) 此系統(tǒng)中，四甲基乙二胺（TEMED）稱為加速劑，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使過硫酸氨（APS，引發(fā)劑）形成自由基。這些自由基的產(chǎn)生可以引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)反應(yīng)，形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。

2. 核黃素—TEMED光聚合催化系統(tǒng) 此系統(tǒng)中，核黃素經(jīng)紫外線光解形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系統(tǒng)主要用用于大孔濃縮膠的配置。

凝膠孔徑的可調(diào)性及性質(zhì)

1）聚丙烯酰胺凝膠的孔徑的大小是由單體和雙體在凝膠中的總濃度（T），以及雙體占總濃度的百分含量（C）即交聯(lián)度決定的。通常凝膠的篩孔、透明度和彈性是隨著凝膠濃度的增加而降低的，而機(jī)械強(qiáng)度卻隨著凝膠濃度的增加而增加

2）凝膠濃度與孔徑的關(guān)系： T與C不僅與凝膠的機(jī)械性能有關(guān)，還與凝膠的孔徑關(guān) 系極為密切。一般講，T濃度大，孔徑小，移動(dòng)顆粒 穿過網(wǎng)孔阻力大。此外，孔徑還同Acr與Bis的比例有 關(guān)，Bis占Acr總濃度5%時(shí)，孔徑最小。

3）凝膠濃度與被分離物相對(duì)分子量質(zhì)的關(guān)系：由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過可移動(dòng)顆粒的相對(duì)分子質(zhì)量也不同。在操作時(shí)，可根據(jù)被分離物相對(duì)分子質(zhì)量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠(標(biāo)準(zhǔn)膠)，因?yàn)樯矬w內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)在此范圍內(nèi)電泳均可取得較滿意的結(jié)果。如分析未知樣品時(shí)也可用4%-10%的梯度膠測(cè)試，根據(jù)分離情況選擇適宜的濃度以取得理想的分離效果。